검정 곡선 (Calibration Curve) 평가와 가중치 (Weighting) 적용 예시

실제 실험결과의 검정곡선 평가 및 가중치 (weighting) 적용 내용을 확인해 보자!

발표된 논문의 검정곡선 평가 방법과 교정을 위해서 사용된 가중치 (weighting) 적용 사례를 확인하고
엑셀로 내용을 구현해서 논문 내용과 비교해 보았다.
장비의 측정결과가 보고된 내용의 논문들이 거의 없지만, 
해당 논문은 검정곡선의 평가 내용을 주로 다루고 있어서 측정결과를 확인할 수 있었다.

참고문헌: Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., & Arnold, M. E. (2014). Selecting the Correct Weighting Factors for Linear and Quadratic Calibration Curves with Least-Squares Regression Algorithm in Bioanalytical LC-MS/MS Assays and Impacts of Using Incorrect Weighting Factors on Curve Stability, Data Quality, and Assay Performance. Analytical Chemistry, 86(18), 8959–8966.

실험 내용은 1 배치 (batch)에서 2 회 반복측정으로 표준물질을 측정하였고, 
같은 표준물질의 농도로 3 배치의 실험 결과를 보여주었다. 
그리고 1회 측정한 표준물질 검정곡선으로 내용을 평가하였다. 
검정곡선의 평가방법은 back-calculated concentration을 확인하고,
정확성 허용기준  ± 15% 이내에 오차가 발생하는지 확인하였다. 
Back-calculated concentration 내용은 아래 링크를 통해서 확인할 수 있다. 

2023.12.26 - [기기분석 데이터] - [Excel] 검정 곡선 (Calibration Curve) 교정 : 가중치 (Weighting)

[Excel] 검정 곡선 (Calibration Curve) 교정 : 가중치 (Weighting)

 

1회 측정 결과의 선형 회귀분석 결과에서 확인된 일차방정식으로
검정곡선 수식 작성에 사용한 표준물질의 반응값을 이용해서
농도 (back-calculated concentration)를 계산해서 상대오차 (RE: relative error)를 확인하면,
아래와 같이 낮은 농도에서 정확도 허용기준   ± 15%을 벗어나는 것이 확인된다.
나머지 5회 검정곡선에서도 오차 범위가 -203.3% ~ 110.0%로 넓게 분포하였다. 

Back-calculated concentration	Accuracy (%RE)
-0.08	-138.1%
0.14	-64.7%
0.57	-28.4%
4.00	0.0%
20.61	3.1%
100.58	0.6%
159.58	-0.3%
199.98	0.0%

1회 표준물질의 결과로 작성되는 검정곡선으로 
계산된 농도값이 낮은 농도에서 매회 다르게 나타날 수 있다는 것을 의미한다.

낮은 농도의 측정 오차 문제점을 확인하기 위해서
잔차도와 등분산성을 확인해 보았다.
잔차도와 등분산성 내용은 아래 링크를 보면 자세한 내용을 확인할 수 있다. 

2023.12.26 - [기기분석 데이터] - [Excel] 검정 곡선 (Calibration Curve) 평가 : 잔차도 (Residual Plot)

2023.12.31 - [기기분석 데이터] - [Excel] 검정 곡선 (calibration Curve) 평가 : 등분산성 (Homoscedasticity)

6회 표준물질을 측정한 검정곡선과 잔차도 내용을 확인해 보면 다음과 같은 그래프가 확인된다. 

검정곡선에서는 높은 농도값에 차이가 나타나는 것이 관찰되고, 낮은 농도에서는 큰 차이가 없는 것으로 보였다.

검정곡선과 실제 측정 값의 차이를 보여주는 잔차도에서도 높은 농도에서 잔차가 크게 발생되는 것이 확인된다.
농도 차이로 인한 측정결과의 분산 차이가 두드러지는 것이 분명하지만, 등분산성의 내용도 아래와 같이 검증했다.

Level	Variance	Degree of freedom (n-1)
First Level	0.000016	5
Last Level	5.484489	5
F_experimental	343302.16
p-value	$7.87 \times 10^{-14}$
Probability	99%
F_critical one-tail	10.97
Homoscedaticity	No

등분산성을 확인한 테스트 결과에서도 낮은 농도와 높은 농도의 분산이 통계적의 유의한 차이가 있다고 검증되었다.
통계적 유의성은 확률을 나타내는 p-value로 분산 차이를 검증할 수 있으며, 
분산이 동일하지 않을 확률 기준 0.01 보다 낮은 p-value $7.87 \times 10^{-14}$ 으로 계산되어 
낮은 농도와 높은 농도의 측정값은 분산 차이가 크다고 설명된다.

그 외에 검정곡선에 시스템 오차가 발생했는지 확인하기 위해서
표준화 잔차도 (normalized residual plot)를 추가로 확인하였다. 
분산이 너무 큰 경우 시스템 오차가 잔차도에서 확인이 불가할 수 있기 때문이다.

표준화 잔차도에서 시스템 오류는 나타나지 않는 것으로 확인되어
넓은 측정 범위에서 높은 농도의 측정값 분산이 상대적으로 증가해서 발생되는 문제이다.
이와 같은 경우 검정곡선의 가중치 (weighting)을 적용하면 
매회 측정된 검정곡선의 안전성 및 농도의 정확도를 개선할 수 있다. 

 위 테이블에서 확인한 동일한 결과를 가중치를 적용해서 농도를 다시 확인해 보았다.  

Weighting 1/$x$		Weighting 1/$x^2$		Weighting 1/$y$		Weighting 1/$y^2$
Back- calculated concentration	Accuracy (%RE)	Back- calculated concentration	Accuracy (%RE)	Back- calculated concentration	Accuracy (%RE)	Back- calculated concentration	Accuracy (%RE)
0.18	-11.0%	0.20	-1.9%	0.18	-11.3%	0.20	-2.0%
0.39	-1.4%	0.41	1.7%	0.39	-1.5%	0.41	1.8%
0.82	3.0%	0.83	3.2%	0.82	2.9%	0.83	3.3%
4.24	5.9%	4.15	3.8%	4.24	5.9%	4.16	4.0%
20.78	3.9%	20.26	1.3%	20.78	3.9%	20.31	1.5%
100.42	0.4%	97.83	-2.2%	100.43	0.4%	98.03	-2.0%
159.17	-0.5%	155.05	-3.1%	159.19	-0.5%	155.37	-2.9%
199.40	-0.3%	194.24	-2.9%	199.42	-0.3%	194.64	-2.7%

가중치 1/$x^2$ 적용에서 모든 농도의 오차가 적게 나타나는 것이 확인되었고,
6회 측정의 검정곡선에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 
가중치 1/$x^2$ 가 적용된 모든 검정곡선의 그래프와 잔차도는 아래와 같이 확인된다.  

가중치가 적용된 검정곡선와 잔차도의 결과를 미적용 가중치 결과와 비교해 보면
높은 농도에서 잔차의 분포 범위가 감소된 것이 확인된다. 
이런 효과로 매회 측정된 검정곡선 기울기와 절편의 재현성 (RSD: relative standard deviation)은 
미적용 가중치 기울기와 절편 보다 낮은 값을 나타낸다.
가중치를 적용한 검정곡선은 실험 마다 비슷한 수식이 만들어 지고 있다는 것을 의미하며,
매회 계산된 농도의 오차도 일정한 값을 나타내고 있다는 것이다.   

가중치가 적용된 back-calculated concentration으로 확인된 오차 범위는 
상대오차 %RE -3.5 ~ 4.8%로 허용기준 ± 15% 보다 낮고, 
미적용 가중치 상대오차 %RE 보다도 낮은 값으로 계산된 것이 확인된다.

논문 자료를 바탕으로
엑셀로 확인한 내용의 파일을 첨부파일로 업로드합니다.
상세한 내용은 엑셀 파일을 참조해 주세요. 
감사합니다. 

Calibration curve_Weighting_Residual plot_V1.xlsx

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