검정곡선 (Calibration Curve) 농도 설정과 반복 측정

검정곡선 (Calibration Curve) 문제 해결 방법으로 사용되는
설정 농도의 변경과 반복 측정을 실험 데이터로 확인해 보자. 

검정곡선 (Calibration Curve)는 장비의 측정값 (Response)과
표준물질 농도 (Concentration)의 상관성을 나타내는 수식으로
시료 분석물질의 농도를 계산할 때 꼭 필요하다.
장비의 측정값은 상황에 따라서 불안정한 값을 나타내므로
실험마다 확인하는 작업이 필요하다.
하지만, 검정곡선 수식이 실험할 때마다 불안정한 결과를 보인다면 측정 농도는 오차가 증가된다. 
검정곡선의 오류에서 발생되는 측정 농도의 오차를 줄이기 위한 방법으로
설정 농도의 변경과 반복 측정이 사용된다. 
해당 내용의 검증을 위해서 모의 실험 데이터를 사용해서 차이를 알아보고자 한다.  

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검정곡선과 관련된 체계적 문헌고찰 (systematic reviews)에 아래와 같은 내용이 권장된다.  

Increasing the number of calibration standards in a calibration procedure enables better mapping of the detector  response and reduces the error estimate, thus increasing  the accuracy and precision of a calibration regression model.

An alternative approach with similar performance is to increase the number of calibration replicates while using  fewer calibration standards.

참고문헌: Cheng, W. L., Markus, C., Lim, C. Y., Tan, R. Z., Sethi, S. K., & Loh, T. P. (2023). Calibration practices in clinical mass spectrometry: Review and recommendations. Annals of laboratory medicine, 43(1), 5-18.

위 내용을 정리하면 검정곡선의 설정 농도가 증가하면 정확성 및 정밀성이 개선되고, 
각 농도의 반복은 최소한으로 사용되며 반복 측정 횟수가 증가하면 결과 값이 개선될 수 있다고 한다. 

해당 내용을 검증하기 위해서 모의 실험 데이터를 만들어서 검증하였다. 

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모의실험 데이터 

모의 실험 데이터는 일정한 조건에서 발생되는 무작위 값을 만들어서 검정곡선을 만들어서 비교하였다. 
분석물질의 농도와 측정값의 직선의 상관성을 나타내는 값을 설정하고, 
일정한 재현성을 나타내는 3회 모의 데이터를 계산하였다.
실험의 재현성 기준은 % RSD 깂이 15%를 넘지 않도록 설정하였다. 
잔차의 패턴이 나타나지 않게 하기 위해서 
측정 오차는 인접한 값이 서로 다른 양 또는 음의 오차가 되도록 설정하였다.  

모의실험 데이터는 엑셀의 RAND() 함수를 사용해서 무작위 값이 나타나도록 하였기 때문에
적절한 데이터를 선정하는 기준이 필요했다.
검정곡선의 데이터 선정 기준은 
잔차의 무작위 패턴, 결정계수, 잔차 제곱의 합, 재현성 (%RSD)을 모두 고려해서
검정곡선 평가에 문제가 나타나지 않는 데이터를 선택하였다.  

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표준물질 농도의 설정 변경 

밸리데이션 가이드라인에는 제시되는 검정곡선 농도 설정의 최소 개수는 5개이다.
검정곡선 실험에 많이 사용되는 단계 희석법 (Serial dilution)으로 농도 설정해서
모의실험 데이터를 만들고, 일차방정식의 검정곡선 내용을 확인하였다.    

Concentration	Test 1	Test 2	Test 3		Mean	SD	%RSD
0.5	10253	9409	11116		10260	853.4	8.32%
1	18400	20460	17252		18704	1625.5	8.69%
2	42162	39600	42415		41392	1557.7	3.76%
5	90151	110119	91289		97186	11214.6	11.54%
10	225609	178693	211874		205392	24120.3	11.74%
Slope	22400.8	18062.31	21023		20495	2216.9	10.82%
Intercept	-5567.84	4825.827	-2995.76		-1246	5413.3	434.48%
R2	0.9889	0.9855	0.9940		0.9895	0.00432	0.44%

각 농도의 측정값 재현성은 15% 이하의 값을 나타내고, 
기울기와 결정계수의 재현성은 15% 를 초과하지 않았지만, 절편은 15% 를 초과하였다. 

아래 내용은 이전 검정곡선의 농도 설정 범위를 동일하게 설정하고, 
범위 내에 더 많은 농도 포인트를 설정해서 검정곡선에 결과를 얻었다.

Concentration	Test 1	Test 2	Test 3		Mean	SD	%RSD
0.5	11019	9166	11422		10536	1203.0	11.42%
1	19480	20933	17723		19379	1607.1	8.29%
2	44363	36218	43085		41222	4380.3	10.63%
4	75252	84978	69963		76731	7616.3	9.93%
6	124151	104703	126232		118362	11874.7	10.03%
8	150062	173531	152981		158858	12791.0	8.05%
10	229197	176101	201888		202395	26551.4	13.12%
Slope	21524.94	18742.21	19934.02		20067	1396.1	6.96%
Intercept	-3501.77	2178.806	-661.006		-661	2840.3	-429%
R2	0.9801	0.9715	0.9936		0.9818	0.01114	1.14%

이전 보다 더 많은 농도 설정 (n=10)의 검정곡선 결과를 보면 
적은 수의 농도 설정 (n=5)의 기울기, 절편, 결정계수에서 큰 차이를 보이지는 않았지만, 
기울기는 더 많은 농도 설정 (n=10)에서 재현성이 더 좋아지는 것이 확인된다. 

정확성 및 정밀성 내용을 확인하기 위해서 
개별 Test 1, 2, 3의 검정곡선 수식에
농도 3개에 비례하는 장비 측정값을 대입해서 계산된 농도를 사용하였다. 

설정 농도 차이에 의한 정확성은 상대오차 (%Error)로 계산하였고,
정밀성 상대표준편차 (%RSD)로 계산하였다.
아래 그래프는 각 농도의 상대오차 값을 나타낸 것으로 
검정곡선의 설정 농도 (n=10)에서 계산된 농도 값이 상대적으로 적게 퍼지는 것이 확인된다. 

위 그래프 내용을 표로 정리하면 다음과 같다.  

Concentration	Calibration point ( n = 5 )		Calibration point ( n = 10 )
	% Error	% RSD	% Error	% RSD
1.5	-7.1 ~ 5.9%	7.1%	-1.0 ~ 3.8%	2.5%
4.0	-4.5 ~ 4.0%	4.3%	-3.0 ~ 3.8%	3.4%
9.0	-8.0 ~ 7.8%	8.2%	-5.3 ~ 5.4%	5.3%

3회 반복 측정의 개별 계산 농도의 오차 (%Error) 범위가 n=10 일 때 줄어드는 것이 확인되고, 
관련되어 재현성 (%RSD)도 감소되는 것이 확인된다. 
동일한 측정 조건에서 검정곡선의 설정 농도의 개수가 증가하면 
측정 농도의 정확성 및 정밀성이 개선되는 것이 확인할 수 있었다.

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표준물질 농도의 반복 측정 

참고문헌에서 각 농도의 반복 측정도 검정곡선의 개선에 도움이 된다고 하였다. 
이 내용을 확인하기 위해서 
위에서 사용한 Test 1, 2, 3 데이터를 반복 측정 결과로 사용하여 검증하였다. 

단계 희석법 (Serial dilution) 농도 설정 (n=5)의 모의실험 데이터를 사용해서 
동일한 조건의 반복 측정 결과 (Test 1, 2, 3) 데이터를 평균해서 정확성과 정밀성 내용을 비교하였다.
정밀성 내용을 확인하기 위해서 추가 데이터를 얻어서 반복 측정의 3회 데이터의 상대표준편차를 계산하였다. 

검정곡선의 수식과 결정계수 내용을 비교하면, 
반복 측정의 평균으로 검정곡선의 수식을 작성한 경우에서
개별 측정에 비해서 결정계수가 1에 가까운 값으로 계산되었다. 
반복 측정의 평균은 잔차가 줄어드는 현상을 나타내었다.
하지만, 반복 측정의 평균 값 (n=5) 대신 모든 개별 값 (n=15)으로
결정계수를 계산하면 이전 개별 측정의 결정계수의 평균값으로 계산되기 때문에 
검정곡선의 수식이 개선되지 않았다.   

Concentration	Test 1	Test 2	Test 3		Mean
0.5	10253	9409	11116		10260
1	18400	20460	17252		18704
2	42162	39600	42415		41392
5	90151	110119	91289		97186
10	225609	178693	211874		205392
Slope	22400.8	18062.31	21023		20495
Intercept	-5567.84	4825.827	-2995.76		-1246
R2	0.9889	0.9855	0.9940		0.9991

계산 농도의 정확성 및 정밀성 내용을 확인해서 아래 표로 작성하였다. 

Concentration	Replicate ( n = 1 )		Replicate ( n = 3 )
	% Error	% RSD	% Error	% RSD
1.5	-7.1 ~ 5.9%	7.1%	-1.1 ~ 1.1%	1.2%
4.0	-4.5 ~ 4.0%	4.3%	-0.6 ~ 0.8%	0.7%
9.0	-8.0 ~ 7.8%	8.2%	-1.2 ~ 1.4%	1.3%

검정곡선 측정 농도의 반복 측정 횟수가 증가하면, 
정확성 및 정밀성의 값이 낮아지는 것이 확인되었다.

측정값의 랜덤 오류가 증가해서 검정곡선이 불안정한 경우에는
계산된 농도값의 정확성 및 정밀성이 나빠지는 현상이 발생된다. 
이런 경우 농도 설정 개수의 증가와 측정 농도의 반복 측정으로
문제점을 개선될 수 있다는 내용을 모의실험 데이터를 통해서 확인하였다. 

하지만, 모든 검정곡선의 문제들이 이와 같은 방법으로 해결되지는 않는다. 
여러 가지 문제들로 검정곡선에 문제점이 나타나기 때문에 
해당 문제를 파악하고, 문제와 연관된 내용을 개선하는 것이 가장 중요하다.