검정곡선 (Calibration Curve) 표준물질의 반복 측정은 언제 필요한가?

검정곡선 (Calibration Curve) 표준물질의 반복 측정은
모든 실험에서 필요한 것인지
아니면 실험 조건에 맞게 다르게 적용되는 것이지 알아보자. 

이전 글에서 검정곡선 (Calibration Curve)의 오류를 수정하는 방법으로
표준물질 농도 설정과 반복 측정이 도움이 되는 것을 확인하였다.
일정 농도 범위에서 설정된 농도를 추가하거나,
각 농도의 표준물질을 반복 측정해서 얻은 평균 측정값으로 검정곡선을 작성하면
1차 방정식 기울기와 절편의 오차가 감소하는 것을 확인하였다.    

2024.09.15 - [기기분석 데이터] - 검정곡선 (Calibration Curve) 농도 설정과 반복 측정

위 내용만 보면 검정곡선의 반복 측정이 꼭 필요한 실험으로 인식될 수 있겠다는 생각이 들었다.
반복 측정은 검정곡선의 문제 해결 방법 중 하나로 모든 문제를 해결하지는 못한다.
이번 글에서는 어떤 조건에서 반복 측정이 효과적인지 소개하려고 한다. 

단일 측정의 검정곡선

반복 측정의 검정곡선

다양한 분석법에서 검정곡선은 정해진 농도 범위에서 5개 이상 농도를 임의로 설정하고,
각 농도의 표준물질을 1회 측정 또는 2회 이상 반복 측정하는 실험으로 진행한다.
분석법마다 표준물질의 단일 측정 또는 반복 측정을 결정하는 요소가 무엇일까?

예를 들어, HPLC 분석에서 검정곡선 실험은 표준물질의 단일 측정 결과로 수식을 만들지만
ELISA 분석에서 표준물질의 2회 반복 측정이 사용되는 것을 자주 볼 수 있다. 
하지만, 모든 ELISA 분석이 표준물질의 반복 측정을 사용하는 것이 아니고
ELISA 분석 항목이 다른 경우에는 1회 또는 2회 이상 측정하는 내용들을 확인할 수 있다.

표준물질의 반복 측정은 분석 장비 차이보다는 다른 원인으로 설정된다고 봐야 한다.
여러 가지 원인들이 관여되어 있지만, 그중에 가장 큰 원인은 분석법의 재현성 (정밀도)이다.
측정된 결과의 재현성이 나쁜 경우에는 측정 오차를 줄이기 위해서 반복 측정이 사용된다. 
반대로 재현성이 좋은 분석법인 경우에는 반복 측정 없이 검정곡선이 작성된다.

이번 글에서는 재현성이 다른 실험법으로 확인된 검정곡선이
단일 측정과 반복 측정으로 검정곡선이 어떻게 변화되는지 알아보려고 한다. 

첫 번째로 검정곡선을 만들기 위한 실험 데이터가 필요하기 때문에 
재현성이 다른 모의 데이터를 실제 분석 결과와 유사하게 만들었다. 
장비를 이용해서 측정된 정상적인 검정곡선 데이터의 패턴을 확인해 보면
농도가 낮을수록 재현성을 나타내는 RSD % 값이 증가하고, 
검정곡선의 잔차 (Residual) 패턴이 무작위 오차를 나타낸다.

위 두 가지 조건을 만족하는 데이터를 만들기 위해서 
기준이 되는 1차 방정식  $ y = 10x + 0 $ 을 설정하고
농도가 낮아지면 RSD % 값이 증가되도록 하였다. 
무작위 오차 (Random error)를 가지는 잔차 (장비 측정값 - 수식 예측값)는 
앞서 사용한 1차 방정식을 기준으로 각 농도마다 RSD% 다른 잔차를 
+ 또는 - 값이 되도록 생성하였고, 인접한 잔차는 서로 다른 양(+)과 음(-)이 되도록 하였다. 
이와 같이 잔차를 설정한 이유는 정상적인 검정곡선에서 나타나는 패턴으로 
자세한 내용은 이전 글에서 확인할 수 있다. 

2023.12.26 - [기기분석 데이터] - [Excel] 검정 곡선 (Calibration Curve) 평가 : 잔차도 (Residual Plot)

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* 재현성 (RSD%)가 낮은 분석법의 검정곡선에서 단일 측정과 반복 측정 차이

검정곡선을 만들기 위한 모의 데이터는 앞서 설명한 기준에 부합된 무작위 선정된 결과로 만들었다. 

Concentration	True Response	Response 1	Response 2	Response 3	Response 4
1	10	9.12	10.17	9.50	10.87
2	20	20.49	18.65	21.14	19.26
3	30	28.45	30.19	27.70	31.65
4	40	41.60	39.13	42.37	36.96
5	50	49.76	52.21	48.53	50.55
6	60	63.50	57.22	60.51	58.33
8	80	77.27	80.14	77.57	85.19
10	100	104.22	98.01	104.66	94.91

기준으로 설정한 수식 $ y = 10x + 0 $ 을 적용해서 농도 비율 (가장 높은 농도 / 가장 낮은 농도)이 10이고,
기준 측정값 (True Response)은 기울기가 10으로 농도의 10 배에 해당하는 값이다. 
표준물질 농도를 분석법으로 측정되었을 때를 고려해서 오차와 서로 다른 양 또는 음의 잔차를 가지도록 하였다. 
모든 농도의 측정 재현성 RSD% = 3.1 ~ 7.8% 으로 확인되었고, 
농도가 감소할수록 RSD% 는 증가하는 경향을 보여주었다. 

해당 데이터를 단일 측정 데이터로 검정곡선을 작성하였을 때 차이를 확인하였다.

	Response 1	Response 2	Response 3	Response 4	Mean	RSD
Slop	10.316	9.862	10.271	9.794	10.06	2.7%
Intercept	-0.990	0.140	-1.073	0.719	-0.30	-291.1%
$ R^2 $	0.9950	0.9975	0.9945	0.9895	0.9942	0.34%

단일 측정으로 확인된 검정곡선의 수식은 참값 기울기 10과 참값 절편에 가까운 값을 보여주었고, 
기울기의 재현성 RSD는 표준물질 측정값 보다 낮은 값을 나타내었다. 
반대로 절편의 재현성 RSD는 측정값 보다 더 높게 계산되었다. 

2회 반복 측정으로 기울기 절편에 변화를 확인하기 위해서 기존 데이터를 2개씩 묶어서 기울기와 절편을 확인하였다.  

	Response 1 - 2		Response 3 - 4		Mean	RSD
Slop	10.089		10.03		10.06	0.4%
Intercept	-0.425		-0.177		-0.30	-58.1%
$ R^2 $	0.9954		0.9915		0.9934	0.27%

2회 반복 측정은 단일 측정에 비해서 기울기와 절편의 재현성이 더 좋아지는 것이 확인된다.
일정한 기울기와 절편은 농도 오차를 줄이는데 도움 되므로 반복 측정이 농도 오차를 줄이는데 도움이 될 것이다.

하지만, 단일 측정과 반복 측정의 검정곡선이 시료 농도 계산에서 오차가 어느 정도 감소되는 확인이 필요하다.
단일 측정과 반복 측정으로 농도 계산에 오차가 큰 차이를 보이지 않는다면, 
단일 측정의 검정곡선으로도 농도 계산이 가능하다. 

이 부분을 확인하기 위해서 표준물질 범위의 농도와 벗어난 농도를 기준이 되는 수식으로 계산하고
다시 각각의 검정곡선으로 계산했을 때 농도의 정확성 (Recovery%)이 어떻게 변하는지 확인하였다. 

Concentration	True Response	Calibration Curve 1 (Recovery%)	Calibration Curve 2 (Recovery%)	Calibration Curve 3 (Recovery%)	Calibration Curve 4 (Recovery%)
0.5	5	116%	99%	118%	87%
1.5	15	103%	100%	104%	97%
4.5	45	99%	101%	100%	100%
8.5	85	98%	101%	99%	101%
12.5	125	98%	101%	98%	102%

검정곡선 범위 1 ~ 10 사이의 계산된 농도 정확도 (Recovery%)는 97 ~ 104%로 나타나고, 
범위를 벗어난 낮은 농도 0.5에서는 정확도는 87 ~ 118%로 오차가 더 크게 발생되었다. 
반대로 높은 농도 12.5에서는 정확도는 98 ~ 102%로 더 증가하지는 않았다. 

2회 반복 측정으로 계산된 검정곡선으로 확인된 정확도는 다음과 같다. 

Concentration	True Response	Calibration Curve 1 - 2 (Recovery%)		Calibration Curve 3 -4 (Recovery%)
0.5	5	108%		103%
1.5	15	102%		101%
4.5	45	100%		100%
8.5	85	100%		100%
12.5	125	99%		100%

계산된 시료 농도의 정확성은 단일 측정보다는 Recovry% 값이 이전보다 100%에 가까운 값을 보인다.
하지만, 표준물질의 재현성 RSD% 값 7.8% 보다 모두 낮은 값을 보이고 있기 때문에 
단일 측정의 검정곡선으로 계산된 농도의 정확성은 반복 측정의 검정곡선으로 계산된 농도는
분석법의 재현성 오차 범위 안에 존재하기 때문에 반복 측정이 꼭 필요하지 않다는 것이 확인된다. 

재현성이 좋은 분석법은 단일 측정으로 확인된 검정곡선으로 시료의 농도를 계산할 때 
오차가 다소 발생되지만 측정 오차 범위 내에서 발생되는 수준의 오차이기 때문에 
검정곡선 실험에서 표준물질의 반복 측정이 꼭 필요한 것은 아니다. 
효율적인 분석 진행을 위해서는 최소한의 표준물질을 측정이 더 이점이 많다.

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* 재현성 (RSD%)가 큰 분석법의 검정곡선에서 단일 측정과 반복 측정 차이

재현성 RSD%가 이전보다 큰 분석법의 검정곡선을 만들기 위해서 앞에서 설정한 기준에
RSD% 값만 수정해서 데이터를 아래와 같이 만들었다.  

Concentration	True Response	Response 1	Response 2	Response 3	Response 4
1	10	7.97	12.06	8.97	10.75
2	20	21.74	18.38	20.66	17.93
3	30	29.71	31.87	29.83	30.78
4	40	40.50	38.56	40.11	39.30
5	50	46.36	50.78	47.24	53.78
6	60	62.44	57.55	60.47	59.62
8	80	73.60	80.93	73.21	84.03
10	100	101.87	95.50	101.79	93.23

모든 농도의 측정 재현성 RSD% = 2.2 ~ 18.3% 으로 확인되었고, 
농도가 감소할수록 RSD% 는 증가하는 경향을 보여주었다. 
재현성이 좋은 데이터에 비해서 높은 RSD%을 나타내고 있고,
최소 RSD% 은 이전보다 낮지만 큰 차이는 없었다. 
무작위 방식으로 데이터를 생성되도록 하였기 때문에 
RSD%는 더 낮은 값을 보였지만, 낮은 농도에서는 더 큰 값을 나타내었다. 
무작위로 숫자를 적용하게 만들었을 때 가장 낮은 농도는 
최대 RSD%는 30% 이내에 무작위 숫자가 만들어지도록 하였다. 
그 보다 다소 낮은 값을 나타냈지만, 이전 데이터보다 더 큰 값을 가지고 있는 것이 확인된다.

해당 데이터를 단일 측정 데이터로 검정곡선을 작성하였을 때 차이를 확인하였다.

	Response 1	Response 2	Response 3	Response 4	Mean	RSD
Slop	9.921	9.562	9.853	9.694	9.76	1.65%
Intercept	-0.339	1.587	-0.248	1.420	0.61	171.91%
$ R^2 $	0.9897	0.9957	0.9922	0.988	0.9913	0.35%

단일 측정으로 확인된 검정곡선의 수식은 참값 기울기 10과 참값 절편에 가까운 값을 나타냈지만, 
재현성이 좋은 분석법에 비해서 더 큰 차이를 보였다. 
기울기의 RSD는 표준물질 측정값 보다 낮은 값을 나타내고, 절편의 RSD는 큰 값으로 계산되었다.
이런 현상은 재현성이 좋은 분석법에 보인 결과와 패턴이 동일하였다.
하지만, 전체적인 RSD 값은 재현성이 좋은 분석법에 비해 큰 값을 보였다. 

2회 반복 측정으로 기울기 절편에 변화를 확인하기 위해서 기존 데이터를 2개씩 묶어서 기울기와 절편을 확인하였다.  

	Response 1 - 2		Response 3 - 4		Mean	RSD
Slop	9.871		9.773		9.76	0.23%
Intercept	0.624		0.586		0.61	4.42%
$ R^2 $	0.9923		0.9896		0.9909	0.19%

2회 반복 측정은 단일 측정에 비해서 기울기와 절편의 재현성이 더 좋아지는 것이 확인되고,
재현성이 좋은 방법과 비교해서 큰 차이점이 없는 RSD 값을 보여주었다.  
RSD 값이 큰 분석법에서 반복 측정의 검정곡선은 재현성이 좋은 분석법 검정곡선과 
비슷한 수준의 검정곡선을 얻을 수 있다는 것을 보여준다. 

각각의 검정곡선으로 계산했을 때 농도의 정확성 (Recovery%)을 확인한 결과는 다음과 같다. 

Concentration	True Response	Calibration Curve 1 (Recovery%)	Calibration Curve 2 (Recovery%)	Calibration Curve 3 (Recovery%)	Calibration Curve 4 (Recovery%)
0.5	5	108%	71%	107%	74%
1.5	15	103%	94%	103%	93%
4.5	45	102%	101%	102%	100%
8.5	85	101%	103%	102%	101%
12.5	125	101%	103%	102%	102%

검정곡선 범위 1 ~ 10 사이의 계산된 농도 정확도 (Recovery%)는 93 ~ 103%로 나타나고, 
범위를 벗어난 낮은 농도 0.5에서는 정확도는 71 ~ 108%로 오차가 더 크게 발생되었다. 
반대로 높은 농도 12.5에서는 정확도는 101 ~ 102%로 더 증가하지는 않았다.
해당 결과는 재현성이 좋은 결과와 동일한 패턴으로 확인된다. 
재현성이 좋은 분석법에 비해서 오차 범위는 더 큰 것으로 나타났다. 
참값에 해당하는 측정값 (Response)을 1차 방정식에 대입했지만, 
수식의 차이로 농도 오차는 더 크게 발생되었다.   

2회 반복 측정으로 계산된 검정곡선으로 확인된 정확도는 다음과 같다. 

Concentration	True Response	Calibration Curve 1 - 2 (Recovery%)		Calibration Curve 3 -4 (Recovery%)
0.5	5	90%		90%
1.5	15	98%		98%
4.5	45	101%		101%
8.5	85	102%		102%
12.5	125	102%		102%

계산된 시료 농도의 정확성은 단일 측정보다는 Recovry% 값이 이전보다 100%에 가까운 값을 나타내고,
반복 측정 검정곡선으로 계산된 농도 범위의 정확성 (98~102%)은
단일 측정 검정곡선으로 계산된 농도 범위의 정확성 (97~104%)과 큰 차이를 보이지 안았다.

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재현성이 않 좋은 분석법의 검정곡선의 수식 오류를 줄이기 위해서 
표준물질의 반복측정은 정확한 농도를 계산하기 위해서 필수적인 선택이지만, 
재현성이 좋은 분석법은 표준물질의 반복측정 없이 검정곡선을 사용해도
허용되는 범위에서 오차가 발생되기 때문에 반복 측정이 필수적인 실험 내용이 아닌 것을 확인하였다. 

정확한 농도 측정을 위해서 검정곡선의 수식을 잘 만드는 것도 중요하지만, 
측정 오차는 검정곡선에서만 발생되는 것이 아니기 때문에
오차를 발생시키는 원인을 잘 파악하는 것이 중요합니다.
자세한 내용은 첨부한 엑셀 파일로 확인할 수 있습니다. 

Calibration curve repeatabilty_V1.xlsx

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